稱取一定量WPI，加無C02水配制成3％(w／v，以蛋白質(zhì)計)底物濃度，90℃滅酶10min，冷卻至室溫后，調(diào)節(jié)至最適pH值，加入5％(w／v)酶，充分混勻，置于超級恒溫器中，調(diào)節(jié)溫度至55℃開始反應(yīng)，酶解5h，間隔一定時間，定量移取，通過煮沸2min滅酶終止反應(yīng)，10000rpm離心20re_in，取上清液測定水解度。
　　
　　1．4TNBS法測定水解度　　
　　

      參考Adler-Nissenn0~123方法略作修改，酶解液0．125ml，加入含有l(wèi)m1磷酸鹽緩沖液(0．2125mol／LNaH2P04加入0．2125mol／LNa2HP04中直至pH值為8．2±0．02)小管中，再加入1ml0．1％(w／v)TNBS，在避光條件下，放入50℃恒溫水浴鍋中，振蕩反應(yīng)60min后取出，室溫冷卻20min，再加入2ml0．1mol／LHCI終止反應(yīng)，稍微振蕩一下，在340nm波長處測定吸光度。標準曲線繪制采用L一亮氨酸作標準品，在0---,40mmol／L范圍內(nèi)繪制。DH計算公式如(1)所示：

　　
　　式中：Am為蛋白水解前氨基氮含量，(rnmoL／g蛋白)；AN2為蛋白水解后氨基氮含量(mmoL／g蛋白)；N口b為蛋白底物中肽鍵氮含量(mmoL／g蛋白)，即蛋白氮。
　　
　　1．5pH—Stat法測定水解度
　　
　　pH—Stat法主要是基于蛋白質(zhì)水解過程中，總伴隨質(zhì)子釋放或吸收n3~1鍆，質(zhì)子化多少，依賴于溶液pH，通過加入用于維持體系pH的堿或酸量，直接計算水解度。DH計算公式如(2)所示：

　　
　　式中：B為NaOH標準溶液體積，(m1)：Nb為NaOH標準溶液濃度，(mol／L)；Q為氨基離解度；M。為底物中蛋白質(zhì)總含量，(g)；Htot為底物蛋白質(zhì)肽鍵總數(shù)，(mmol／g)，本文核桃蛋白Htot值是8．0mmol／g。
　　
　　1．6甲醛滴定法測定水解度
　　
　　取水解滅酶后8．0ml酶解液，置于200ml燒杯中，加入60IIll無C02水，開動磁力攪拌器，加少量堿液調(diào)節(jié)pH為8．20，再加入10Ⅱll中性甲醛溶液，用0．5mol／LNaOH標準溶液調(diào)節(jié)體系pH值至9．20，記錄消耗NaOH標準溶液體積為V(m1)。
　　
　　同時取未酶解相同濃度蛋白質(zhì)溶液8．0ml，按上述方法作空白試驗，記錄消耗NaOH標準溶液體積為vo(m1)。DH計算公式如(3)所示：

　　
　　式中：C為NaOH標準溶液濃度，(mol／L)；V為酶解液消耗NaOH標準溶液體積，(m1)；V0為空白液消耗NaOH標準溶液體積，(m1)；0．014為氮毫克當量；N為底物樣品總氮含量，(g)。
　　
　　2結(jié)果與討論
　　
　　2．1L-亮氨酸標準曲線
　　
　　按1．4方法選用L_亮氨酸作標準品，TNBS顯色后測定吸光度，繪制標準曲線，見圖1。由圖l可看出，游離氨基質(zhì)量濃度與吸光度呈線性關(guān)系，線性方程為：r--o．1208x+0．0555，R2=o．9917，換算成Jd心關(guān)系為C=8．278A-o．459(mmol／L)

　　
　　2．2三種方法測定結(jié)果
　　
　　2．2．1Alcalase2．4L酶解WPI測定結(jié)果
　　
　　本實驗在一定酶解條件下，即3％核桃蛋白溶液(w／v)、加入5％(w／v)Alcalase2．4L、調(diào)節(jié)pH值為8．0、溫度為55℃，間隔不同酶解時間后，移取酶解液分別進行水解度測定。測定水解度時甲醛滴定法和TNBS法都是基于對游離氨基酸進行定量，預(yù)期兩種方法測定水解度比較接近，但數(shù)據(jù)顯示并不接近。由圖2可看出，在采用Alcalase2．4L酶解核桃分離蛋白時，pH—Stat法和TNBS法測定值接近，方差分析結(jié)果表明，TNBS法僅比pH—Stat法平均低0．4％。而甲醛滴定法比兩者稍低，這是因脯氨酸與甲醛作用后，生成不穩(wěn)定化合物，導(dǎo)致滴定結(jié)果偏低。
　　
　　因此采用甲醛滴定法測定富含脯氨酸原料，其結(jié)果偏低；采用甲醛滴定法測定微弱水解物水解度時，誤差較大。核桃蛋白質(zhì)含有一定量脯氨酸(4．29％)n卯，脯氨酸與甲醛反應(yīng)生成不穩(wěn)定化合物，導(dǎo)致測定結(jié)果偏低；而TNBS法并未有此現(xiàn)象，這就解釋TNBS法測定結(jié)果與pH—Stat法基本一致，而甲醛滴定法偏低結(jié)果。

　　
　　2．2．2Protamex酶解WPI測定結(jié)果
　　
　　核桃分離蛋白酶解因目標物是短肽，所以應(yīng)盡量避免使用外切蛋白酶。根據(jù)文獻相關(guān)報道，本實驗除采用水解度較高Alcalase2．4L(內(nèi)切蛋白酶)外，還根據(jù)目標物生理活性，選用Protamex(內(nèi)切和外切肽酶復(fù)合體)進行酶解。加入5％Protamex、調(diào)節(jié)pH值為7．0、溫度為50℃，經(jīng)不同酶解時間后，取酶解液分別進行水解度測定。

　　
　　由圖3可知，與Alcalase2．4L酶解不同的是，用Protamex酶解時，甲醛滴定法與pH-Stat法接近，均低于TNBS法；方差分析結(jié)果表明，TNBS法測定結(jié)果與另兩法差異顯著(P<0．05)。甲醛滴定法偏低原因在2．2．1已予解釋；而pH-Stat法測定值偏低是由于其水解度計算與l／a有關(guān)，而Ct與溫度、pH值及氨基解離度(pK)有關(guān)，計算公式如(4)式：

　　
　　在Protamex酶解條件下，若溫度和pH值都不變，a僅取決于pK值，由于游離氨基酸、二肽和三肽氨基基團pK值比多肽稍高¨們，采用Protamex水解時，由于含部分外切酶，所以酶解產(chǎn)物含有較多游離氨基酸和二肽、三肽，故在用pH-Stat法測定水解度時I／a偏低就導(dǎo)致計算水解度降低。在用Alcalase2．4L進行酶解時，由于是內(nèi)切肽酶，游離氨基酸和二肽、三肽很可能會相對降低，這意味在水解過程中I／0【值變化可忽略不計，pH-Stat法測得值應(yīng)較精確，
　　
　　3結(jié)論
　　
　　pH—Stat法被證實是一種簡單、快速測定WPI水解液水解度方法，可重復(fù)性高，通常被用于水解度連續(xù)測定。然而該法在研究中需用其它方法加以校正，且所測得水解度值精確度依賴于所使用酶種類；當使用富含外切蛋白酶時，pH—Stat法所測水解度值低于預(yù)期值。甲醛滴定法也是一種較為常用測定WPI水解度方法；但因WPI富含脯氨酸，與甲醛生成不穩(wěn)定產(chǎn)物，使測定值偏低，所以測定核桃分離蛋白時，甲醛滴定法精確度較低。TNBS法被證實也是一種較好測定WPI水解度方法，非常靈敏，且不受酶特異性影響；但由于需要較長反應(yīng)時間和冷卻步驟，所以，不能實時反應(yīng)水解過程水解度。
　　
　　但值得一提的是，酶解WPI獲取多肽主要目標物是短肽，使用的酶大多為內(nèi)切蛋白酶：所以，采用pH—Stat法測定WPI水解液水解度時所得值應(yīng)較為準確